DNA凝胶电泳详细操作步骤

操作步骤

1. 准备琼脂糖凝胶

• 根据需要分离的DNA片段大小，选择合适的琼脂糖浓度（通常0.7%至1.5%）。（一般来说，0.3% 琼脂糖凝胶适合分离较大的DNA片段，范围在5-60 kb。0.6% 琼脂糖凝胶适合范围在1-20 kb。0.7% 琼脂糖凝胶适合范围在0.8-10 kb。0.9% 琼脂糖凝胶适合范围在0.5-7 kb。1.2% 琼脂糖凝胶范围在0.4-6 kb。1.5% 琼脂糖凝胶范围在0.2-3 kb。2.0% 琼脂糖凝胶范围在0.1-2 kb。）

• 称取适量的琼脂糖粉末，加入0.5×TBE电泳缓冲液，加热至完全溶解，冷却至60℃左右。

• 加入适量的溴化乙锭（EB）至最终浓度为0.5μg/ml，混匀。

2. 制胶

• 清洁并组装制胶板和梳子，确保没有气泡。

• 倒入含有EB的琼脂糖溶液，插入梳子形成加样孔。

• 让琼脂糖凝胶凝固，然后小心拔出梳子。

3. 设置电泳槽

• 将凝固的凝胶放置在电泳槽中，确保凝胶完全浸没在0.5×TBE电泳缓冲液中。

4. 加样

• 将待测DNA样品与6×加样缓冲液混合，轻轻混匀。

• 使用移液枪将样品小心加入凝胶的加样孔中，避免产生气泡。

• 在电泳过程中，将已知大小的DNA片段（如λDNA/HindⅢ Marker）一同进行电泳。这些标准DNA片段在电泳图谱上形成一系列条带，作为分子量的参照标准。

5. 电泳

• 连接电泳仪，设置电压（通常5V/cm，不超过4V/cm）。

• 开始电泳，直至染料前沿（溴酚兰）迁移至凝胶的适当位置。

6. 染色（如果凝胶中未预先加入EB）

• 电泳结束后，将凝胶浸泡在含有0.5μg/ml EB的染色液中，染色30分钟。

7. 观察和记录

• 将染色后的凝胶放置在紫外透射仪上，使用适当的波长（360nm或254nm）观察DNA条带。

• 记录结果，拍照或扫描以保存数据。

注意事项

8. 安全操作

• EB具有致癌性和致突变性，应穿戴防护服、手套和护目镜，因为这些染料具有潜在的毒性和诱变性。

• 在紫外光下观察染色后的凝胶时，应采取适当的防护措施

• 使用EB时，应在通风良好的条件下进行，并避免吸入EB粉尘。

• 使用一次性手套，并在操作前后洗手。

9. 凝胶制备

• 确保琼脂糖完全溶解，避免凝胶中有气泡。

• 制胶时，确保凝胶板和梳子清洁，避免凝胶表面不平整。

10. 电泳条件

• 根据DNA片段大小选择合适的电压和电泳时间。

• 避免过高的电压，以免DNA片段压缩在凝胶前沿。

11. 染色和观察

• 如果凝胶中未预先加入EB，染色步骤不能省略。

• 观察时应使用适当的波长，避免过度曝光。

12. 数据记录

• 记录所有实验条件，包括凝胶浓度、电泳电压和时间等。

• 保存清晰的电泳图谱，以便后续分析。