“分子剪刀手”DNase I 你了解多少？

"分子剪刀手”DNase I 你了解多少？

一． DNase I 定义

DNase I（Deoxyribonuclease I）即脱氧核糖核酸酶I，是一种能够非特异性识别并结合到DNA分子上，对底物DNA的磷酸二酯键进行非特异性切割，使底物分子产生单脱氧核苷酸或寡脱氧核苷酸的非特异性双链核酸内切酶。

二． 作用机制

DNase I 作用机制涉及两个主要的步骤：

（1）与底物进行非特异性结合

（2）进行水解反应

DNase I作用机制示意图

1.与底物进行非特异性结合

DNase I首先将通过静电的相互作用与DNA双螺旋结构的磷酸骨架结合，其氨基酸残基与DNA的磷酸基团相互结合形成离子键或氢键，使酶与DNA分子的结合更加稳定。

虽然DNase I对底物DNA分子的作用通常被定义为非特异性裂解，但它更易于作用在某些片段：小沟区域且容易发生嘌呤—嘧啶序列的裂解。

DNA分子的磷酸二酯键骨架暴露在外围且具有大沟小沟的结构特征使得DNase I的活性位点与DNA分子间存在高度的适配性。并且DNA的磷酸二酯键还能与DNase I周围的关键氨基酸相互作用形成离子键或者氢键。

2. 进行水解反应

与DNA分子结合后，DNase I的活性中心结构域与DNA分子作用。酶的活性位点提供特定的微环境和氨基酸残基，降低反应活化能，并利用水分子对磷酸二酯键进行亲核攻击，使底物分子的磷酸二酯键断裂，生成相应的寡核苷酸片段。

三．作用条件

DNase I在本质上为一种核酸酶，它具备有酶的特征，同时它也依赖于Ca²⁺维持其活性结构以及辅助因子的激活。

DNase I的作用条件可以总结为以下几点：

①在37℃左右、pH=7.0-8.0范围内具有较高的生理活性；

②需要二价金属阳离子（一般为Mg²⁺或Mn²⁺）的激活;

③通过加热（65℃，10min）或者EDTA处理可灭活DNase I。

DNase I在低浓度的离子环境中可以提高生理活性，但同时在不同的离子环境中，它对底物的切割方式也有所不同：

①在Mg²⁺存在的环境中，DNase I会随机切割双链DNA分子形成寡脱氧核苷酸片段；

②在Mn²⁺存在的环境中，DNase I可以在DNA双链的大致同一位置进行切割形成平末端或粘性末端

不同离子环境下DNase I切割底物方式示意图

四．应用场景

DNase I在生物学上有广泛的应用：提取纯化RNA去除DNA；其它应用：基因表达、蛋白组学结合转录组学研究及检测疾病相关RNA标志物等。

下面具体介绍DNase I在去除DNA污染中的应用以及注意事项：

具体操作步骤如下：

1.核酸的提取

（1）样品准备

A.组织样本

取新鲜组织约100mg加入Trizol试剂约1ml（1000μl Freezol），冰上研磨切碎并用无菌匀浆器制备形成匀浆。冰上静置裂解5min，将样品转移至离心管中。

B. 细胞样本

悬浮细胞离心收集细胞（贴壁细胞可用胰酶消化制成细胞悬液），弃上清液，每1×10^5~1×10^7个细胞加入1ml Trizol(500μl Freezol reagent),涡旋振荡至充分裂解静置5min，将样品转移至离心管中。

（2）RNA提取

核蛋白复合物完全裂解后，每毫升样本液加入0.2ml氯仿；用力振荡15s后室温孵育2-3min；4℃，12000r离心15min，分离上层水相；每毫升样品加入0.5ml异丙醇沉淀RNA，混匀室温孵育10min，弃上清，用75%乙醇洗涤，干燥RNA样品。

2.RNA的纯化

方法1：在RNA提取的过程中加入纯化

在使用Trizol等试剂提取RNA时，在裂解细胞后可加入适量的DNase I，并在适宜的条件（37℃、pH=7-8）下进行孵育一段时间，DNase I将会发挥作用，特异性降解DNA分子，再进行后续的RNA提纯处理。

方法2：在RNA提取后再进行纯化

当RNA已完成提取却发现有DNA污染时，将1μgRNA与10x DNase I反应缓冲液（含MgCl₂）1μl、无RNase DNase I 一单位充分混匀加入用DEPC处理的无RNase水使反应体系总体积达到10μl，37℃裂解30min，加入1μl 50mM EDTA，65℃孵育10min，最后通过氯仿抽提、乙醇沉淀等方法进行提纯与去除DNase I消化产物。

提取RNA去除DNA，操作时，需要注意以下事项：

（1）酶量和反应时间

根据RNA样本中DNA含量和样本量，优化DNase I的用量及反应时间。用量少或反应时间过少会出现DNA去除不彻底，用量过多或作用时间过长可能出现降解RNA的情况。

（2）反应条件

严格控制反应的温度及pH值。一般DNase I在pH=7-8，37℃具有较高的生理活性。

（3）RNA酶污染

RNA比DNA更易被降解，应使用无RNA酶的试剂、耗材，并在冰上或低温环境下进行操作，防止RNA酶污染。

DNase I在生物学上其它应用及进展：在细胞内，DNase I参与DNA的修复、重组等过程；在纳米技术中：与纳米基团的结合以增强DNA的污染分析技术，对防止PCR实验中由于DNA污染可能出现的非异性扩增以及在基因测序中由于DNA污染导致杂峰出现或错误序列影响真实序列的解读具有重要的作用意义；DNase I还与疾病的形成与发生具有重要的联系。

五、产品介绍

DNase I 脱氧核糖核酸酶 I 200U RNase Free：来源于牛胰岛素，不含RNase(RNase free)、不含其他DNA酶，可以用于各种RNA样品的处理。DNase I 通过水解作用切割DNA分子的磷酸骨架，裂解DNA分子，可用于DNA-蛋白质相互作用研究（足迹法)、RNA提取中的DNA污染去除、染色质可及性分析（DNase-seq)、体外转录和翻译系统的优化、细胞凋亡检测、DNA损伤与修复研究、基因编辑与克隆、DNA标记与探针制备、环境样本中DNA降解、病毒DNA的检测等。