血泪教训 | 提取RNA巨巨巨详细的注意事项

一、实验环境

1. 洁净无 RNA 酶实验环境：

1. 原理：环境中的 RNA 酶会迅速降解 RNA，导致提取的 RNA 质量下降甚至无法获得完整的 RNA。RNA 酶广泛存在于人的皮肤、唾液、灰尘等中，极微量的 RNA 酶就可能造成 RNA 的降解。

2. 措施：使用专用的 RNA 提取实验室或在超净工作台中进行操作，实验台面用75%的酒精进行擦拭杀菌，最好用 RNase 去除剂擦拭，所用的移液器、离心管、吸头等耗材均为无 RNA 酶的产品或灭菌后的产品。个人需戴好口罩手套穿好实验服，避免个人的污染导致RNA提取失败。

2. 仪器试剂提前预冷：

1. 原理：低温状态下，会极大地抑制RNA 酶的活性，降低RNA提取过程的损失。

2. 措施：离心机4℃预冷，所有的试剂（包括需要配置的试剂：75%乙醇等）置于4℃使用。

二、实验材料

1. 样本新鲜：

1. 原理：新鲜的样本中 RNA 完整性较好，随着样本存放时间的延长，RNA 会逐渐降解。

2. 措施：尽量使用新鲜采集的样本进行 RNA 提取，若不能立即提取，可将样本保存在适当的条件下，如液氮或 -80℃冰箱中，以减缓 RNA 的降解速度；或者立即加入裂解液并且彻底而迅速地匀浆

2. 选择合适的提取方法：

1. 原理：不同的样本类型（如细胞、组织、血液等）需要采用不同的提取方法，以确保最大程度地提取出高质量的 RNA。

2. 措施：对于细胞样本，可以使用 Trizol 法、试剂盒法等；对于组织样本，可能需要先进行匀浆处理再采用相应的提取方法；对于血液样本，有专门的血液 RNA 提取试剂盒。

三、实验操作

1. 低温操作：

1. 原理：低温可以降低 RNA 酶的活性，减少 RNA 的降解。

2. 措施：在提取过程中，尽量在冰上操作，如样本的匀浆、离心等步骤，使用的试剂也可预先放在冰上冷却。

2. 操作迅速：

1. 原理：减少 RNA 暴露在可能含有 RNA 酶的环境中的时间，降低降解风险。

2. 措施：熟悉实验流程，提前准备好所需的试剂和耗材，操作过程中尽量连贯、迅速。

3. 避免剧烈振荡：

1. 原理：剧烈振荡可能会导致 RNA 断裂，影响 RNA 的完整性。

2. 措施：在混匀试剂和样本时，动作要轻柔，避免产生过多的气泡和剧烈振荡。

4. 低温过夜沉淀：

1. 原理：RNA 在特定的沉淀条件下（如加入异丙醇或乙醇等），会随着时间的推移逐渐沉淀下来。温度越低，沉淀的速度可能会相对减慢，但沉淀会更加充分。一些可能与 RNA 一起沉淀的小分子物质或部分蛋白质等杂质，在长时间的低温环境下，可能会保持溶解状态或者与 RNA 的结合力减弱，从而在后续的离心等操作中更容易被去除。

2. 措施：低温过夜沉淀可以使杂质与 RNA 更好地分离，更加充分的沉淀可以增加RNA提取的量和纯度。

5. RNA分层后转移上清（Trizol法为例）：

1. 原理：一般加完氯仿后，提取液将分为三层，其中上清含有RNA，中层含有DNA和小肽等、下层含有蛋白、脂质、细胞或组织碎片等。若不小心取到中下层物质，提取的RNA纯度将有所下降。

2. 措施：倾斜离心管，小心轻轻吸取上清溶液，尽量不要取到中层DNA等物质。

6. 洗涤RNA后需充分风干洗液乙醇：

1. 原理：乙醇会抑制后续的酶反应，如逆转录、PCR 等。如果有残留乙醇，可能会影响 RNA 的质量和下游实验的效果。

2. 措施：可以选择在通风橱中快速风干离心管内残留的乙醇，或者将离心管倒扣于纸巾上晾至没有乙醇。

7. 正确使用移液器：

1. 原理：不准确的移液器操作可能会导致样本损失或污染，影响 RNA 的产量和质量。

2. 措施：使用合适量程的移液器，确保吸取和排出液体时操作准确，避免产生气泡和液体残留。

四、实验后处理

1. RNA 的保存：

1. 原理：合适的保存条件可以维持 RNA 的稳定性。

2. 措施：应特别注意溶解RNA的溶液无RNA酶存在。提取的 RNA 可保存在 -80℃冰箱中，若需要长期保存，可加入适量的 RNA 稳定剂。避免反复冻融，以免 RNA 降解。

总之，提取 RNA 时需要从实验环境、实验材料、实验操作和实验后处理等多个方面严格控制，以确保获得高质量的 RNA。