别让RNA搅局！DNA提取去除RNA的4种妙法

    RNA和DNA的结构相似，提取RNA，通常会存在DNA。以下是4种去除RNA的方法。

一、RNase酶解法

1. 基于核酸酶的特异性作用中的RNase的特异性水解：

    核酸纯化柱的结合缓冲液含高浓度盐和特定pH值，利于核酸与基质结合，DNA和RNA与基质结合能力有差异；洗涤缓冲液含乙醇和盐，能去除蛋白质、多糖等杂质，且对DNA和RNA洗脱效果不同，利用这些差异实现DNA和RNA的分离，同时去除杂质，获得纯净DNA。

2.操作步骤

 a. 结合步骤：

    将核酸样本与含高浓度盐和特定pH值的结合缓冲液混合；

    把混合液加入核酸纯化柱，离心使核酸吸附在基质上，倒掉流出液。

  b. 洗涤步骤：用含乙醇和盐的洗涤缓冲液洗涤纯化柱，去除蛋白质、多糖等杂质。

  c. 洗脱步骤：使用低盐洗脱缓冲液（如无核酸酶水或TE缓冲液）洗脱DNA，离心收集含DNA的洗脱液。

3. 注意事项

  a. 操作规范：严格依照纯化柱说明书操作。

  b. 条件把控：准确控制各步骤的离心条件和试剂用量。

  c. 型号选择：依据样本核酸含量和实验要求，挑选合适型号的纯化柱的洗脱液。

三、选择性沉淀法

1.  基于核酸化学结构差异中的化学修饰差异

    一些化学试剂如选择性沉淀剂LiCl，在合适浓度下（如2 - 3M）对RNA的亲和力高，使RNA沉淀，而DNA仍留在溶液中，实现两者分离的洗脱液。

2.操作步骤

  a. RNA沉淀：

    向核酸样本中加入2 - 3M LiCl溶液作为选择性沉淀剂；充分混匀后冰浴30分钟，促使RNA选择性沉淀；在4℃、12000 - 15000rpm条件下离心15 - 20分钟，将含DNA的上清液转移至新离心管，此时RNA沉淀在管底。

  b. DNA沉淀：

    向上清液中加入2 - 3倍体积无水乙醇和1/10体积3M NaAc（pH 5.2）；混匀后在-20℃放置30分钟沉淀DNA；4℃、12000 - 15000rpm离心15 - 20分钟。

  c. DNA洗涤与溶解：

弃上清，用70%乙醇洗涤DNA沉淀2 - 3次；晾干后用适量TE缓冲液或无菌水溶解。

3.注意事项

  a. 沉淀剂相关：

    准确控制沉淀剂浓度，浓度过低无法使RNA完全沉淀；

    严格把控作用时间，时间过短RNA沉淀不充分；

    避免沉淀剂浓度过高，否则可能导致DNA共沉淀；

    防止作用时间过长，以免出现DNA共沉淀情况。

  b. 离心条件：选择合适的离心条件，确保RNA和DNA有效分离。

四、碱处理法

1.基于核酸化学结构差异中的碱水解原理

    DNA和RNA的结构不一样。RNA的核糖上有个2'-OH基团，当处在碱性很强，pH值达到12 - 13的环境里，RNA就容易被水解。

    简单来说，就是它的磷酸二酯键会断开，变成一个个小的核苷酸片段。但DNA是双链结构，相比之下更抗水解，在这种强碱性条件下还能保持基本完整。利用这个特性，就能把DNA和RNA分开，留下我们想要的DNA。

2.操作步骤

  a. 样本转移：将核酸样本转移至合适离心管。

  b. 碱处理：加入适量0.1 - 1M NaOH溶液，使样本pH值达12 - 13，轻轻混匀，室温孵育10 - 15分钟水解RNA。

  c. 中和：加入等体积0.1 - 1M HCl溶液中和，使pH值恢复至中性。

  d. 常规处理：进行常规的核酸沉淀、洗涤和溶解步骤，获取去除RNA的DNA。

3. 注意事项

  a. 碱处理时间和pH值控制：

    严格控制碱处理时间，时间过长可能损伤DNA，时间过短则RNA水解不完全；

    严格控制pH值，pH值过高会损伤DNA ，pH值过低RNA水解不充分。

  b. 中和注意事项：

    中和时需缓慢加入酸性缓冲液；

    加入酸性缓冲液后要充分混匀，避免局部pH值变化过快对DNA结构造成影响。

五、方法选择

1. 样本类型：血液、组织等核酸含量丰富样本，可选择碱处理法、RNase酶解法；微生物、病毒等核酸含量少样本，柱式纯化法更合适，能有效富集DNA。

2. 实验要求：对DNA完整性要求高的实验，如基因组测序，避免使用碱处理法，防止DNA损伤；对纯度要求高的实验，如PCR扩增，可结合多种方法提高DNA纯度。

3. 成本与效率：大规模样本处理，考虑成本和效率，选择性沉淀法成本低、操作相对简单；少量样本精细处理，柱式纯化法虽成本高，但快速、方便。