为什么RNA检测结果会出现假阳性

曾几何时，你是否觉得你的实验在不断错付于你，是否在想为什么理应是阴性的结果会出现阳性？

别急，这有可能是假阳性所致，假阳性是指检测阴性材料得到阳性结果。如果一次实验中的几个阴性对照中出现一个或几个阳性结果，提示本次实验中其它标本的检测结果可能有假阳性。实验中设立的阴性对照可提示有无假阳性结果出现。RNA 反转录扩增过程中出现假阳性结果的原因可能有以下几点：从实验前、实验中、实验后进行分析

实验前

1. 引物设计不合理：引物的特异性不强，可能与非目标 RNA 序列发生非特异性结合，从而导致扩增出假阳性产物。

2. 试剂质量问题：使用的反转录酶、PCR 试剂等质量不合格，可能会影响反应的特异性和准确性，导致假阳性结果。

3. 试剂污染：RT-PCR 检测中使用的试剂，如引物、酶、探针等，可能在生产、运输或储存过程中被污染。例如，引物合成过程中混入了其他核酸片段，或者酶制剂中含有微量的核酸模板，都可能导致假阳性。

4. 样本质量问题：样本中存在抑制物，如血液中的血红蛋白、乳铁蛋白等，可能会干扰核酸提取或扩增过程，导致假阳性结果。样本保存不当也可能影响检测结果。如果样本在不合适的温度下保存时间过长，RNA 可能会降解，或者产生变异，从而引发非特异性扩增。

实验操作中的原因：

1. 基因组 DNA 污染：RNA 样品中可能存在少量的基因组 DNA 污染，这些 DNA 在反转录过程中也会被扩增，导致假阳性结果。

2. 交叉污染：在实验操作过程中，如移液器、试管等实验器材的使用不当，可能会导致不同样品之间的交叉污染，从而出现假阳性。

3. 非特异性扩增：反应条件不合适，如退火温度过低、镁离子浓度过高或过低等，可能会导致非特异性扩增，产生假阳性结果。

4. 气溶胶污染：在 PCR 扩增过程中，气溶胶中的 DNA 片段可能会进入反应体系，导致假阳性结果。

5. 仪器故障：PCR 仪温度控制不准确，可能导致非特异性扩增。例如，退火温度过高或过低，会影响引物与模板的结合特异性，从而产生假阳性结果。荧光检测系统故障，可能导致错误的荧光信号读取。例如，检测器灵敏度异常、光路不清洁等问题，可能使背景信号升高，误判为阳性结果。

实验结束后的原因

数据分析不当：在数据分析过程中，如果荧光信号阈值设置过高或过低，可能导致假阳性或假阴性结果。如果阈值设置过低，微弱的非特异性荧光信号也可能被误判为阳性；如果阈值设置过高，可能漏检低浓度的真实阳性样本。

为了避免假阳性结果的出现，在实验过程中应注意引物的设计和优化、严格控制实验操作过程中的无菌和无污染、优化反应条件、使用高质量的试剂等。同时，设置阴性对照和重复实验可以帮助检测和排除假阳性结果。